Micropropagação do porta-enxerto de videira '420-A'
Micropropagação do porta-enxerto de videira '420-A'1
Micropropagation of '420-A' grapevine rootstock
Pryscilla Menarin DzazioI, 2; Luiz Antonio BiasiII, 3; Flávio ZanetteIII, 4
IProfessora. CEDETEG. Rua Simeão Camargo Varella de Sá, 03.85.040-080.
Guarapuava, PR
IIProfessor Adjunto. Departamento de Fitotecnia e Fitossanitarismo. Setor de
Ciências Agrárias. UFPR. Caixa Postal 19061.80001-970. Curitiba, PR. Bolsista
em Produtividade do CNPq
IIIProfessor Titular. Departamento de Fitotecnia e Fitossanitarismo. Setor de
Ciências Agrárias. UFPR. Caixa Postal 19061. 80001-970. Curitiba, PR
INTRODUÇÃO
A videira apresenta grande valor econômico e social para o desenvolvimento do
nosso País. A atividade concentra-se na produção de uvas de mesa e matéria-
prima na elaboração de vinhos e outros derivados.
O método de propagação mais empregado no Brasil consiste no plantio de porta-
enxertos no local definitivo do futuro vinhedo para posterior enxertia no campo
das variedades de interesse (Souza, 1996). A formação do vinhedo por este
método leva, no mínimo, dois anos e, apesar de apresentar baixo custo, favorece
a disseminação de várias doenças (Regina et al., 1998). As técnicas de
micropropagação são uma importante alternativa visando à formação mais rápida
do vinhedo e à obtenção em larga escala de material vegetativo de boa qualidade
fitossanitária.
A micropropagação de videiras consiste basicamente no processo de enraizamento
de brotações axilares ou adventícias multiplicadas in vitro, para a regeneração
de plantas inteiras. Este processo possibilita a rápida multiplicação de
plantas, a obtenção de plantas-matrizes livres de vírus, a propagação de
híbridos e a preservação de germoplasmas de interesse (Krul & Mowbray,
1984). Os explantes normalmente utilizados são segmentos nodais (Gribaldo &
Fronda, 1991), ápices meristemáticos (Yu & Meredith, 1986) e meristemas
(Passos et al., 1985). Os segmentos nodais constituem-se de microestacas com
apenas 1 gema lateral mais uma pequena porção dos tecidos adjacentes do caule e
pecíolo, variando de 8 a 25 mm de comprimento (Gribaudo & Fronda, 1991;
Martinez & Tizio, 1989; Mullins et al., 1979).
Os ápices meristemáticos são retirados da extremidade apical das brotações com
cerca de 2 a 4 primórdios foliares e 0,5 a 1,5 mm de comprimento (Botti et al.,
1993; Chée & Pool, 1982; Goussard, 1981).
Os meristemas também são retirados da extremidade das brotações, mas possuem um
tamanho menor do que os ápices, atingindo no máximo 0,5 mm de comprimento
(Troncoso et al., 1988; Novák & Juvová, 1983). Meristemas menores do que
0,3 mm dificilmente regeneram novas plantas (Koruza & Jelaska, 1993).
Pela cultura de meristemas, em conjunto com a termoterapia, é possível a
obtenção de clones livres de vírus, que dificilmente são eliminados apenas com
o tratamento térmico (Barlass et al., 1982; Koruza & Jelaska, 1993).
A utilização dos ápices e dos meristemas também permite o estabelecimento de
culturas com baixíssimo índice de contaminação e possibilita a eliminação de
outros patógenos, como viróides, organismos semelhantes a micoplasmas e
bactérias (Barlass, 1987).
A micropropagação também é uma alternativa viável para a multiplicação de
videiras muscadíneas, que apresentam grande interesse para o melhoramento de
plantas, mas cuja propagação através de estacas lenhosas é muito difícil (Gray
& Benton, 1990; Gray & Benton, 1991; Gray & Fisher, 1985; Lee &
Wetzstein, 1990; Thies & Graves Junior, 1992; Wetzstein & Myers, 1994).
O potencial de multiplicação in vitro é elevado, sendo estimado por Botti et
al. (1993) a obtenção anual de 2808990 brotações da cultivar Thompson Seedless,
26494 brotações da cultivar Ribier e 1213 da cultivar Black Seedless em meio MS
com 2 mgL-1 de BAP, a partir de um explante. Harris & Stevenson (1982)
estabeleceram um protocolo capaz de produzir 12000 brotações em 4 meses, a
partir de apenas um ápice meristemático. Na cultura de ápices fragmentados,
Barlass & Skene (1978) estimaram a produção de aproximadamente 8000 plantas
em 4 meses.
Lewandowski (1991) obteve cerca de 3.000 plantas de videira 'Delaware' por mês,
utilizando um meio MS modificado e reduzindo os intervalos de repicagem, mas
ressaltou a importância de novos isolamentos anualmente, em combinação com uma
proliferação limitada de brotações, para reduzir o risco da variação
somaclonal.
Este trabalho foi realizado para estabelecer um protocolo de micropropagação
para o porta-enxerto de videira '420-A'.
MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos foram realizados no Laboratório de Micropropagação de Plantas,
do Departamento de Fitotecnia e Fitossanitarismo do Setor de Ciências Agrárias
da Universidade Federal do Paraná.
Material vegetal:
O porta-enxerto '420-A' é um híbrido originado do cruzamento entre as espécies
Vitis berlandieri e Vitis riparia (Pommer et al., 1997). Para o fornecimento
contínuo e uniforme de explantes, foi utilizada a metodologia adaptada por
Biasi et al. (1998a). As estacas lenhosas foram coletadas em julho de 1999, das
plantas matrizes do viveiro de mudas frutíferas da Fazenda Experimental do
Canguiri da UFPR, localizada em Pinhais-PR. Depois foram tratadas com captan
(2gL-1), enroladas em jornal úmido, acondicionadas dentro de sacos plásticos e
armazenadas em temperatura fria (4 a 6º C). Quando havia necessidade de
explantes, as estacas foram retiradas do refrigerador, cortadas em segmentos
com 2 ou 3 gemas e colocadas para brotar em frascos contendo cerca de 100 mL de
água, na sala climatizada para as culturas in vitro. As brotações das estacas
foram utilizadas como fonte de explantes.
Todos os experimentos foram mantidos dentro de uma sala climatizada, com
fotoperíodo de 16 horas fornecida por lâmpadas fluorescentes do tipo luz do
dia, e temperatura de 25±1º C. Os explantes foram inoculados em tubos de ensaio
de 25 x 150 mm, com 10 mL de meio de cultura. Em todos os experimentos in vitro
o delineamento utilizado foi de blocos ao acaso com 4 repetições e 10 frascos
por parcela. Em cada frasco foi colocado apenas um explante. A avaliação dos
experimentos foi realizada após 30 dias da sua instalação.
Estabelecimento da cultura in vitro:
A assepsia das brotações das estacas, com cerca de 5 nós sem as folhas, que
foram cortadas pelos pecíolos, foi realizada pelo tratamento das brotações com
benomyl (2 gL-1), seguida pela imersão em solução de hipoclorito de sódio
(2,5%) mais Tween 20 (0,1%), por 20 minutos e 4 lavagens em água esterilizada.
O ápice das brotações foi desprezado, e o restante foi dividido em segmentos
nodais com cerca de 1 cm de comprimento cada, possuindo uma gema axilar.
Foram testados o efeito de concentrações de BAP e cinetina: 0, 1, 5 e 10 µM, em
meio de cultura MS com a metade da concentração de sais solidificado com 6,5
gL-1 de ágar. Também foram testadas as seguintes diluições do meio de cultura
MS: MS, MS/2, MS/4 e MS/8 e os seguintes meios de cultura: MS, MS/2, NN e WPM,
sendo utilizado 1 µM de BAP em todos os meios de cultura.
Alongamento e multiplicação:
Os tratamentos foram os seguintes meios de cultura: MS, MS/2, NN e WPM. Os
explantes consistiram em segmentos nodais com 1 folha e gema axilar, com
aproximadamente 10 mm de comprimento, retirados de plantas crescidas in vitro,
provenientes do primeiro subcultivo em meio de cultura isento de reguladores de
crescimento.
Enraizamento:
Os tratamentos foram: meio de cultura MS/2 com e sem 1 gL-1 de carvão ativado.
Os explantes consistiram em segmentos nodais com 1 folha, com aproximadamente
10 mm de comprimento, retirados de plantas crescidas in vitro, provenientes do
primeiro subcultivo em meio de cultura isento de reguladores de crescimento.
Aclimatização:
O delineamento experimental utilizado foi de blocos ao acaso com 3 repetições e
10 plantas por parcela. A aclimatização foi realizada em câmara de nebulização
com intervalo de rega de 30 minutos. Os tratamentos foram os seguintes:
vermiculita, Plantmax® e casca de arroz carbonizada. As plantas enraizadas
foram acondicionadas em tubetes plásticos e a avaliação da sobrevivência foi
realizada após 30 dias.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Estabelecimento da cultura in vitro:
A análise de variância para o efeito de BAP, não apresentou significância sobre
a porcentagem de gemas axilares brotadas, o comprimento das brotações
principais, a porcentagem de segmentos nodais oxidados e a porcentagem de
explantes perdidos por oxidação e contaminação. Porém, adição de BAP no meio de
cultura afetou o número de brotos por explante e o número de folhas presentes
na brotação principal.
A maior quantidade de brotos por explante foi encontrada nos meios com presença
de BAP (Tabela_1). A multiplicidade de brotos é característica deste regulador,
que induz a formação de grandes números de brotos e alta taxa de multiplicação
em muitos sistemas de micropropagação (Martinelli, 1985). Fanizza et al.
(1988), encontraram brotos múltiplos no cultivo de meristemas apicais de
cultivares de Vitis vinifera, especialmente em altas concentrações de BAP (2
mgL-1). Brotos múltiplos de gemas axilares também foram observados no trabalho
realizado por Novák & Juvová (1982).
Encontrou-se maior número de folhas nos tratamentos com ausência de BAP e na
concentração de 1 mM (Tabela_1). Concentrações mais altas diminuíram a
quantidade de folhas, afetando seu desenvolvimento e a qualidade das brotações,
que apresentaram sintomas de vitrificação. A vitrificação é um problema comum
no cultivo de videiras, notadamente, em altas concentrações de BAP (Harris
& Pool, 1985; Gray & Bentom, 1991).
Chée & Pool (1985), trabalhando com o híbrido 'Remaily Seedless', definiram
ótimas concentrações para a multiplicação do broto (5 mM), para produção de
brotos maiores (2,5 mM) e para a máxima expansão dos internos (1 mM),
concluindo que o efeito do BAP, em concentrações mais baixas, foi mais
eficiente na qualidade e crescimento do explante. Para Biasi et al. (1998a), o
aumento da concentração de BAP induziu o crescimento das gemas axilares dos
segmentos nodais do porta-enxerto 'Jales' até a concentração de 11,5 mM, quando
passou a reduzir seu crescimento.
Portanto, concordando com Biasi et al. (1998a) e Lee & Wetzstein (1990),
concentrações de BAP devem ser adequadas para cada cultivar, otimizando o
processo para a obtenção de brotações de boa qualidade e com mínimo de
vitrificação, mesmo que a taxa de crescimento seja menor. Pois, fases
subsequentes dependem do bom estado fisiológico das brotações.
Para o efeito da cinetina, a análise de variância não apresentou significância
para todas as variáveis analisadas. Apesar do efeito da cinetina no
desenvolvimento das gemas axilares não ser significativo, observa-se que para o
comprimento das brotações principais e número de folhas, a concentração de 1 mM
foi superior (Tabela_2). Gray & Benton (1991) observaram a ineficiência da
cinetina na micropropagação de cultivares de videira, onde os meios com e sem a
presença do regulador de crescimento apresentaram o mesmo efeito.
O baixo efeito da cinetina na indução do crescimento e desenvolvimento de gemas
axilares também pode ser observado no trabalho com Vitis rotundifolia
(Sudarsono & Goldy, 1991), e no trabalho realizado por Skene & Barlass
(1980) com ápices fragmentados. Já, Novák & Juvová (1982), observaram que a
cinetina afetou o crescimento e desenvolvimento de meristemas de gemas axilares
em todas as concentrações testadas.
As diferentes diluições do meio de cultura MS testadas apresentaram resultados
significativos para o comprimento da brotação principal, para número de folhas
do explante, para a porcentagem de explantes com calo e para a porcentagem de
explantes perdidos por contaminação e oxidação. A porcentagem de gemas axilares
brotadas e o número de brotos por explante, não foram afetados pelas diferentes
diluições do meio MS.
O maior comprimento da brotação principal da gema axilar foi de 24 mm obtido no
meio de cultura MS com a concentração normal de sais (Tabela_3). Vários são os
trabalhos que indicam o meio MS normal no estabelecimento inicial da cultura
(Lewandowski, 1991; Yu & Meredith, 1986; Goussard, 1982; Goussard, 1981;
Novák & Juvová, 1982; Lu & Wetztein, 1990; Gray & Benton, 1990).
Apesar da superioridade do MS normal, observado neste parâmetro analisado,
existe a tendência dos efeitos do MS normal e MS/2 se igualarem à medida que
são realizados os subcultivos. Já, o MS/4 apresentou uma redução no crescimento
das brotações no primeiro subcultivo realizado após os 30 dias no meio de
indução com presença de BAP.
Para a variável número de folhas, os meios MS normal, MS/2 e MS/4 apresentaram
os maiores números de folhas (Tabela_3).
O MS normal também foi superior no desenvolvimento de meristemas apicais da
cultivar 'Blanc Du Bois' (Gray & Klein, 1989). Estes autores sugerem o
emprego do meio MS normal para a produção comercial, tanto pelo seu uso comum
como pela sua composição ser encontrada em mix. Os resultados deste trabalho
coincidem também com os encontrados por Barlass & Skene (1980b), onde o
meio MS com concentração normal de sais foi superior à concentração reduzida
(MS/2), no crescimento inicial de folhas originadas de ápices fragmentados de
cultivares de Vitis vinifera, e na subsequente capacidade destas folhas em
produzir gemas adventícias.
Os explantes do MS/8 foram os mais afetados pela concentração reduzida dos
sais, apresentando menor crescimento e menor número de folhas. Nesse
tratamento, 80% dos segmentos nodais foram perdidos por contaminação e
oxidação, provavelmente pela concentração reduzida de sais.
O efeito dos tipos de meios de cultura sobre o crescimento inicial das gemas
axilares não foi significativo para todas as variáveis analisadas , exceto para
o número de folhas do explante.
O meio WPM foi o que apresentou menor número de folhas por explante (Tabela_4).
Apesar de não apresentar diferença significativa para comprimento da brotação
principal foi o que apresentou menores valores (Tabela_4). O meio WPM
apresentou brotos raquíticos no trabalho de Gray & Benton (1991).
Coincidindo também com os resultados obtidos com meristemas apicais, onde o
meio WPM apresentou menor número de brotos, sintomas de vitrificação e sofreram
abscisão foliar (Gray & Benton, 1990).
Maiores números de folhas foram obtidos nos meios MS com concentração normal de
sais, MS/2 e NN. Observa-se que, apesar de não diferir significativamente dos
demais tratamentos, o meio MS normal apresenta maiores valores para comprimento
da brotação principal e porcentagem de gemas axilares brotadas. Estes
resultados apresentam a tendência de o MS normal ser superior aos demais meios.
O MS normal foi considerado superior aos demais tratamentos testados (MS/2,
C2D, WPM) no trabalho de Gray & Benton (1990), onde atingiu a média de 3,3
brotos por ápice em 6 semanas.
Já, para as cultivares 'Ribier', Thompson Seedless, e Black Seedless foram
estabelecidas na fase inicial: MS ¾ e fase de proliferação e elongação: MS
normal.
Concentrações reduzidas do meio MS também foram superiores no trabalho de Brian
et al. (1998b), onde os meios MS/2 e NN apresentaram melhores resultados para o
porta-enxerto 'Jales' e não diferiram entre si em todas as variáveis
analisadas.
Alongamento e multiplicação:
A análise de variância apresentou significância para todas as variáveis
analisadas, com exceção para a porcentagem de explantes perdidos por
contaminação ou oxidação.
A média total de explantes não viáveis, ou seja, perdidos por contaminação ou
oxidação em todo o experimento, foi de apenas 18,75%, demonstrando um
desenvolvimento melhor deste porta-enxerto nesta fase de multiplicação.
Os meios MS/2, WPM e NN não diferiram significativamente entre si, em todas as
variáveis analisadas (Tabela_5). Resultados semelhantes foram obtidos com o
porta-enxerto 'Jales', comparando os meios NN e MS/2, que se apresentaram
superiores aos demais e não diferiram entre si (Biasi et al., 1998b).
O MS, com concentração normal de sais, apresentou resultados inferiores para
comprimento da brotação principal, número de folhas do explante e porcentagem
de gemas axilares brotadas, indicando que, para esta fase, menores
concentrações de sais são requeridas (Tabela_5).
Concentrações reduzidas do meio MS foram utilizadas em vários trabalhos (Biasi
et al., 1998b; Botti et al., 1993; Ciccotti, 1982; Fanizza et al., 1984; Harris
& Stevenson, 1982), principalmente na fase de enraizamento das brotações
(Botti et al., 1993 Ciccotti, 1982; Harris & Stevenson, 1982).
O enraizamento, em todo o experimento, atingiu a média de 80,34%. Apesar de não
diferir significativamente dos meios NN e WPM, o MS/2 foi que apresentou maior
índice, 97,5% dos explantes enraizaram em 30 dias (Tabela_5). Este resultado
demonstra a facilidade de enraizamento deste porta-enxerto, fazendo-se
desnecessária uma fase posterior para emissão de raízes.
Brotos de videira produzidos in vitro são facilmente induzidos à produzir
raízes tanto pelo uso do meio contendo auxina como sem o regulador de
crescimento (Gray & Fisher, 1985).
Os maiores números de folhas por explante foram obtidos nos meios MS/2, NN e
WPM, atingindo as médias 2,3; 2,65; 2,31 folhas por brotação, respectivamente,
o que representa, em termos de taxa de multiplicação, considerando a presença
da gema axilar em cada folha, aproximadamente 3 novos brotos a cada 30 dias
(Tabela_5). Biasi et al. (1998b) obtiveram 3,9 folhas por brotação do porta-
enxerto 'Jales' no meio MS/2, em 33 dias.
Enraizamento:
A análise de variância não apresentou significância para todas as variáveis
analisadas, com exceção para número de raízes por explante.
A porcentagem média de enraizamento para os tratamentos MS/2 e MS/2 mais carvão
ativado foi considerada alta, com 80% dos segmentos nodais apresentando raízes
(Tabela_6). Biasi et al. (1998b), também trabalhando com segmentos nodais,
obtiveram para porta-enxerto 'Jales' taxas de enraizamento próximas de 100%, no
meio MS/2 sem auxina. Para a cultivar 'Carbenet Sauvignon', o melhor
enraizamento foi obtido quando se utilizou o meio White sem regulador de
crescimento (Barlass & Skene, 1980b)
Já, para algumas cultivares, a presença de auxina no meio é importante para o
bom enraizamento, como no trabalho de Gray & Klein (1981), que obtiveram
94% de enraizamento da cultivar 'Orlando Seedless', utilizando o meio C2D com
0,4 mM ANA.
Gray & Benton (1991) obtiveram 55% de enraizamento dos brotos de cultivares
de V. rotundifolia, cultivadas em meio MS sem presença de auxina e 77% com
auxina.
A rizogênese é fortemente dependente do genótipo da videira (Roubelakis-
Angelakis & Zivanovitc, 1991) e enraiza facilmente pelo uso de meio de
cultura sem regulador de crescimento ou com auxina (Gray & Fisher, 1985).
O maior número de raízes foi encontrado no meio MS/2 (1,97 raízes/ explante),
enquanto o meio MS com presença de carvão emitiu 1,6 raiz/explante (Tabela_6).
Estes resultados foram bem próximos dos obtidos por Peixoto & Pasqual
(1996), onde 1,42 e 1,35 raíz foram emitidas por explante do porta-enxerto R99,
nos tratamentos com 0,22mM e 0,44mM de ANA, respectivamente. Já o porta-enxerto
'Jales', em meio MS/2, emitiu 2,8 raízes/ explante (Biasi et al., 1998b).
Apesar de os tratamentos MS/2 e MS/2 mais carvão ativado não apresentarem
diferenças significativas entre si, a melhor porcentagem de brotação, maior
comprimento da brotação e maior número de folhas por explante foram observados
no meio MS/2 sem carvão (Tabela_6).
Aclimatização:
A análise de variância apresentou diferença significativa nos tratamentos para
a porcentagem de sobrevivência das brotações.
Os substratos vermiculita e Plantmax® não apresentaram diferenças
significativas entre si, obtendo-se 95,83% e 87,50% de sobrevivência,
respectivamente (Tabela_7).
O menor índice de sobrevivência das brotações foi obtido no substrato com casca
de arroz, onde apenas 45,83% das brotações sobreviveram.
Blazina et al. (1991) obtiveram 90% de sobrevivência utilizando como substrato
uma mistura de vermiculita, solo e mix comercial. Bons resultados também foram
obtidos por Compton & Gray (1994), utilizando uma parte de mistura
comercial e uma de vermiculita.
Pode-se constatar a facilidade de adaptação da videira através de altos índices
de sobrevivência obtidos por vários autores (Koruza & Jelaska, 1993;
Ricciardi & Silvestroni, 1988; Ravindra & Piaus Thomas, 1995;
Lewandowski, 1991; Biasi et al., 1998b).
CONCLUSÃO
Conclui-se que o porta-enxerto de videira '420-A' pode ser micropropagado pelo
seguinte protocolo: cultivo inicial de segmentos nodais, obtidos a partir de
brotações de estacas lenhosas, em meio de cultura MS + 1 µM de BAP, alongamento
das brotações e multiplicação pelo seccionamento das mesmas em meio de cultura
MS/2 isento de reguladores de crescimento e aclimatização em câmara de
nebulização com substrato vermiculita ou Plantmax®.
