Hepcidina: A Molécula-Chave na Regulação do Metabolismo do Ferro
1. Introdução
O ferro é um elemento fundamental para um grande número de funções celulares,
sendo a mais importante o transporte de oxigénio. Ao nível sistémico, o tecido
que mais ferro consome é a medula óssea, que o utiliza no processo de síntese
de hemoglobina pelos eritrócitos. A quantidade de ferro necessária para a
eritropoiese é garantida através de um sistema eficiente de reciclagem no qual
os macrófagos esplénicos fagocitam os eritrócitos senescentes, degradam a
hemoglobina e exportam o ferro para a circulação para ser novamente utilizado.
Se, por um lado, o ferro é um elemento vital para qualquer célula, ele pode ser
também extremamente tóxico através da sua acção catalítica na produção de
radicais livres de oxigénio. Por isso os seres vivos desenvolveram sistemas de
regulação muito estritos do metabolismo do ferro, quer a nível de regulação do
metabolismo intracelular quer ao nível sistémico, garantindo assim que este
elemento não seja nem deficiente nem excessivo. As consequências do
desequilíbrio do metabolismo do ferro são bem conhecidas clinicamente. De um
lado do espectro clínico está a anemia por deficiência de ferro e do lado
oposto as doenças de sobrecarga, em particular a Hemocromatose Hereditária
(HH), na qual a acumulação excessiva de ferro pode levar eventualmente a lesão
tecidular em vários órgãos, com manifestações como a cirrose hepática,
diabetes, hipogonadismo, artrite ou cardiopatia.
2. A descoberta da Hepcidina
Pode dizer-se que a descoberta da hepcidina como o regulador central da
homeostasia do ferro resultou da conjugação de vários estudos por grupos de
investigação independentes que, num curto espaço de tempo isolaram,
caracterizaram e demonstraram o seu efeito sistémico em modelos animais. A
hepcidina foi originalmente isolada em dois estudos paralelos. Krause e
colaboradores identificaram no ultrafiltrado de sangue humano um novo péptido
de 25 aminoácidos rico em cisteínas, com propriedades antimicrobianas a que
chamaram LEAP-1 (liver expressed antimicrobial peptide)1. Paralelamente, Park e
colaboradores caracterizaram o mesmo péptido na urina humana, tendolhe chamado
hepcidina por ser de síntese hepática (hep) e ter actividade antimicrobiana
(cidin)2. A semelhança com o péptido descrito anteriormente no ultrafiltrado de
sangue levou os autores a propor que o péptido tinha origem no fígado e atingia
a urina através da circulação no plasma2. No mesmo ano Pigeon e colaboradores
demonstraram que a produção do péptido era estimulada pela sobrecarga de ferro3
e, quase simultaneamente, Nicolas e colaboradores observaram que o
silenciamento do gene da hepcidina em ratinhos transgénicos provocava um
fenótipo de sobrecarga de ferro semelhante à hemocromatose humana4. No ano
seguinte estes mesmos autores demonstraram que a sobre-expressão de hepcidina
levava a uma deficiência severa de ferro com anemia, confirmando-se assim o
papel fundamental da hepcidina como regulador dos níveis sistémicos de ferro5.
A hepcidina é essencialmente produzida nos hepatócitos, mas estudos mais
recentes têm demonstrado que também é produzida por outras células,
nomeadamente neutrófilos6, monócitos7-8, linfócitos9, adipócitos10, células
beta do pâncreas11 e renais12. O papel da hepcidina de síntese extra-hepática
não se encontra ainda completamente esclarecido, tal como a possibilidade da
sua contribuição para o poolde hepcidina circulante, sendo provável que esta
desempenhe um papel mais relevante na regulação de fluxos de ferro locais,
funcionando num circuito autócrino e parácrino.
3. Regulação da produção de hepcidina
A hepcidina é sintetizada na forma de uma pré-próhormona, uma proteína de 84
aminoácidos biologicamente inactiva13. A maturação da hepcidina no hepatócito
ocorre por clivagem da proteína sob a acção de uma convertase, a furina14-16,
dando origem à sua forma activa, um péptido de 25 aminoácidos que circula no
plasma e é excretado pela urina2. A expressão de hepcidina é regulada
essencialmente por 4 tipos de sinais: 1) sinais de aumento da actividade
eritropoiética; 2) sinais de resposta à concentração de ferro circulante; 3)
sinais de resposta inflamatória e 4) sinais de stress retículo-endoplasmático
(RE). Ao contrário dos dois primeiros tipos de sinal, cujos efeitos
fisiológicos são muito evidentes, i.e., assegurar o aporte necessário de ferro
para a eritropoiese ou proteger da deficiência ou toxicidade do ferro, não é
ainda clara a importância biológica do aumento de hepcidina na inflamação ou em
resposta ao stress RE. Uma compreensão mais aprofundada de todos estes
mecanismos será essencial numa perspectiva de se prever quais as vantagens ou
desvantagens de uma potencial intervenção terapêutica usando a hepcidina como
alvo ou como agente. É de realçar que muitos dos mecanismos de regulação da
hepcidina que se conhecem hoje foram esclarecidos com o estudo de modelos de
doença, nomeadamente através da descoberta de mutações patogénicas em genes
relevantes. Nos capítulos seguintes serão descritos mais detalhadamente esses
mecanismos e tornar-se-á aparente que muitos dos sinais e vias de activação
estão interligados, não havendo provavelmente processos de controlo
completamente independentes ou que não sejam compensados por outros.
3.1. Regulação da hepcidina pela anemia, hipóxia e eritropoiese
A síntese de hepcidina é inibida em todas as situações de estímulo da
actividade eritropoiética, tendo como efeito garantir a mobilização de ferro
para a medula óssea.
Os mecanismos moleculares envolvidos nesta resposta são variados.
Na hipóxia, o principal sistema regulador envolve os chamados Hypoxia Inducible
Factors(HIFs). Em condições de tensão normal de oxigénio, a subunidade α do HIF
é hidroxilada e degradada através da via ubiquitina-proteossoma numa interacção
com o gene supressor tumoral de von Hippel-Lindau (VHL). Pelo contrário, em
situações de hipóxia ou de deficiência de ferro, a hidroxilação é inibida,
resultando na estabilização da subunidade α do HIF e consequente activação de
todos os genes que respondem especificamente a este factor de transcrição, como
é o caso do gene da eritropoietina (EPO). Recentemente foi demonstrado que a
hepcidina é um dos alvos do HIF-117, que se liga à região promotora do gene da
hepcidina e diminui a sua transcrição.
A EPO é produzida pelo rim em condições de hipóxia ou deficiência de ferro,
actuando, através da interacção com o seu receptor (EPOR), como o principal
agente anti-apoptótico nos eritroblastos. A injecção de EPO é um potente
inibidor da síntese de hepcidina in vivo18. O mecanismo, ou mecanismos, pelo
qual a EPO actua como inibidor da hepcidina é ainda um assunto em investigação.
Para além do efeito indirecto no aumento da eritropoiese, a EPO tem também um
efeito directo de inibição da síntese de hepcidina pelos hepatócitos, através
da regulação do factor de transcrição C/EBPα, mediada pelo EPOR19.
Um outro mediador da regulação negativa da hepcidina é o GDF15, um membro da
família TGFβ de factores de crescimento, que se encontra muito elevado no soro
de doentes com talassemia associado à expansão da massa eritrocitária21.
Recentemente, foi também demonstrado que o GDF15 é estimulado em condições de
deplecção celular de ferro, uma descoberta que apoia o facto de este factor
estar também aumentado no soro de indivíduos deficientes em ferro ou após a
administração de quelantes do ferro21.
Em condições de hipóxia existe também um aumento da concentração de radicais
livres de oxigénio (ROS), o que também foi proposto como um mecanismo possível
de repressão da expressão de hepcidina através da alteração das actividades do
C/EBPα e STAT-322.
3.2. Regulação da hepcidina pelos níveis de ferro
Em condições de sobrecarga de ferro a hepcidina é induzida fisiologicamente
para diminuir os níveis de ferro circulante e assim proteger da toxicidade do
ferro3. A regulação da expressão da hepcidina em resposta ao ferro envolve
outras moléculas, que funcionam como sensores de ferro e cujos mecanismos de
acção explicam hoje a patogénese da maioria das doenças genéticas de sobrecarga
de ferro, particularmente a HH.
A proteína HFE é o produto do gene responsável pela HH do adulto. Embora
considerado um importante regulador da expressão da hepcidina, o seu mecanismo
de acção ainda não está completamente esclarecido. O HFE interactua com os
receptores da transferrina, TfR1 e TfR2, este último essencialmente expresso no
fígado23. O complexo HFE-TfR2 (que se pensa ser formado em condições de elevada
saturação da transferrina, por inibição competitiva da ligação HFETfR1) é um
indutor da expressão da hepcidina através da via MAPK/ERK24. Não está ainda
completamente esclarecido se o HFE é necessário como sensor da concentração
de ferro ou se é apenas essencial para a produção basal de hepcidina25.
A proteína hemojuvelina (HJV) é o principal responsável pelas formas mais
severas de Hemocromatose Juvenil e é um co-receptor de Bone Morphogenic Protein
(BMP). As BMPs são membros da família TGFβ e induzem a transcrição do gene da
hepcidina através da via das SMADs26. A HJV pode ser clivada pela furina
(curiosamente, a mesma convertase responsável pela maturação da hepcidina) e
libertada numa forma solúvel que, ao contrário da HJV de membrana, é capaz de
inibir a produção de hepcidina, possivelmente por um mecanismo de competição
com as BMPs.
Embora várias BMPs sejam capazes de induzir a expressão de hepcidina, a BMP6 é
o mediador essencial para a resposta da hepcidina ao ferro no fígado27,28.
Recentemente foi descrito que o HFE também interactua com a via de sinalização
da BMP6 para regular a expressão de hepcidina, quer no modelo animal de
deficiência de HFE29, quer em doentes com HH homozigóticos para a mutação C282Y
do HFE30.
Uma nova molécula envolvida na via de activação HJV/BMP é a serina-protease
TMPRSS6, também conhecida como matriptase-231. A deficiência de TMPRSS6 é a
responsável pela anemia com deficiência de ferro resistente ao ferro, conhecida
como IRIDA (iron-refractory iron deficiency anemia). A TMPRSS6 está envolvida
na proteólise da HJV, sendo assim um inibidor da hepcidina32. Recentemente foi
demonstrado que esta protease é também regulada por factores induzidos pela
hipóxia33, evidenciando-se mais uma vez a inter-relação entre todos os
mecanismos reguladores da hepcidina.
3.3. Regulação da hepcidina na inflamação e no stress RE
Possivelmente ligado à sua função como péptido antimicrobiano, a produção de
hepcidina é induzida pela inflamação, sendo responsável pelo quadro de anemia
da inflamação, também chamada anemia da doença crónica, num processo mediado
pela IL-6 e envolvendo a via de sinalização JAK/STAT334,35. Outras citoquinas
inflamatórias, tais como o TNF, poderão também estar envolvidas, mas o seu
mecanismo ainda não é bem conhecido9.
O stress do RE é um processo bem conhecido nas células expostas a agentes
tóxicos, alterações nutricionais ou outros agentes patológicos que interferem
com o normal processamento das proteínas recém-sintetizadas no RE, induzindo um
conjunto de respostas coordenadas conhecido como unfolded protein response
(UPR). Esta resposta tem como objectivo manter o controlo de qualidade do RE e
ajudar a célula a adaptar-se ou a recuperar de condições de stress. No entanto,
esta resposta também tem sido apontada como um factor de progressão de doença
em certos casos, como por exemplo na doença hepática crónica36. Dois artigos
recentes mostraram que o stress RE em resposta a vários químicos é capaz de
modular a expressão de hepcidina nos hepatócitos37,38.
3.4. Regulação da maturação da hepcidina
A maturação da hepcidina no hepatócito ocorre por clivagem da proteína sob a
acção da furina, dando origem à sua forma activa, como um péptido circulante de
25 aminoácidos, e uma fracção pró-hepcidina. Os mecanismos exactos de regulação
desta maturação são ainda muito mal conhecidos, sendo igualmente desconhecido o
papel biológico da pro-hepcidina circulante. Muito recentemente foi demonstrado
que o complexo HFE-TfR2, através da via de sinalização MAPK/ERK, regula a
expressão de furina, podendo, desse modo, contribuir também para a regulação da
maturação da hepcidina39.
4. A acção da hepcidina: o eixo hepcidina/ferroportina
O papel da hepcidina como regulador da homeostasia do ferro tem sido
extensamente estudado, sendo claro que actua como regulador do influxo de ferro
para o plasma a partir dos tecidos, nomeadamente dos enterócitos que absorvem o
ferro da dieta, dos macrófagos que reciclam o ferro a partir dos eritrócitos
senescentes, e dos hepatócitos que constituem o principal reservatório de
ferro. Ao nível molecular, a hepcidina liga-se ao único exportador celular de
ferro conhecido, a ferroportina, induzindo a sua internalização e
degradação40,41. Mutações neste exportador estão na origem da chamada doença da
ferroportina, uma forma de hemocromatose autossómica dominante e com
características fenotípicas próprias que a distinguem de outras formas de HH42.
Embora a hepcidina tenha sido primeiro descrita como um péptido anti-
microbiano, esta acção nunca foi bem caracterizada nos mamíferos. Pelo
contrário, ao mediar a retenção de ferro nos macrófagos, a hepcidina pode ser
responsável por favorecer o crescimento de microrganismos que utilizam este
metal para o seu próprio crescimento43. Se a hepcidina circulante não parece
ser eficiente como anti-microbiano, ainda está por esclarecer o seu papel
quando é produzida pelas células do sistema imune. Recentemente foi descrito
que também os linfócitos são capazes de produzir hepcidina que, ao inibir a
ferroportina, induz a retenção do ferro, contribuindo assim para o controlo da
sua própria proliferação9. A possibilidade de que a hepcidina sistémica possa
contribuir para a activação e proliferação dos linfócitos à periferia é um
assunto que está presentemente a ser investigado. Recentemente foi também
proposto que a hepcidina poderá ter um outro papel na inflamação através da
modulação da transcrição de citoquinas pró-inflamatórias44.
6. A importância da hepcidina na prática clínica
A descoberta da hepcidina e dos seus mecanismos reguladores veio explicar a
patogénese de muitas doenças do metabolismo do ferro. No caso da HH, por
exemplo, veio-se a esclarecer que todas as mutações descritas nos genes HFE,
TfR2, HJV e HAMPtêm um mecanismo patogénico comum que consiste na produção
inapropriada, ou ausência de produção, de hepcidina em resposta ao excesso de
ferro. Mas também em situações de sobrecarga de ferro adquirida, como nos casos
da sobrecarga associada a doenças hepáticas crónicas como a hepatite C, ou a
doença alcoólica, existe uma deficiência de produção de hepcidina45. Ao
contrário, no fígado gordo nãoalcoólico (NASLD) existe um aumento da expressão
da hepcidina46,47. Nestes casos, o aumento da hepcidina por inflamação crónica
ou stress do RE favorece a depleção de ferro do sangue e a sua retenção nas
células do sistema reticulo-endotelial, nomeadamente nas células de Kupffer,
podendo estimular ainda mais a resposta imune e sendo assim um factor de
agravamento da própria doença36. No caso da IRIDA, mutações no gene da TMPRSS6
são responsáveis pelo defeito de inibição da expressão da hepcidina em resposta
ao ferro, sendo uma das características clínicas o aumento de hepcidina
circulante48.
No contexto clínico, não há dúvida que o doseamento da hepcidina terá muito
interesse no diagnóstico, classificação e seguimento dos doentes com as
perturbações descritas do metabolismo do ferro, em particular no diagnóstico de
formas raras de hemocromatose, na distinção entre uma hiperferritinémia de
causa inflamatória ou por sobrecarga hepática de ferro e no diagnóstico clínico
de IRIDA. Apesar do seu interesse clínico, não tem sido fácil implementar o
doseamento da hepcidina na rotina laboratorial, sobretudo porque as
metodologias que permitem medir concentrações das formas de hepcidina
fisiologicamente relevantes são muito problemáticas e a sua disponibilidade
para a comunidade médica que faz investigação clínica tem sido muito limitada.
Os primeiros estudos de doseamento de hepcidina em modelos humanos foram
realizados com um ensaio de doseamento de hepcidina urinária baseado na sua
extracção da urina por um método de cromatografia de troca iónica com
subsequente detecção por um anticorpo específico49. Este teste era muito
laborioso e realizado apenas pelo próprio laboratório que produzia o anticorpo.
Mais tarde foram introduzidas as técnicas de doseamento da hepcidina por
espectroscopia de massa50,51, que têm uma boa reprodutibilidade e podem dosear
a hepcidina não só na urina como também no soro, mas que dependem de
equipamento muito dispendioso e que não se encontra facilmente disponível. Em
termos de métodos imunoenzimáticos, foi descrito inicialmente um teste para
detecção de pró-hepcidina, com um kit de ELISA comercialmente disponível52. No
entanto, este teste nunca foi validado clinicamente já que os seus resultados
não se relacionam com as concentrações esperadas de hepcidina-25 nem com outros
parâmetros do metabolismo de ferro, não se sabendo ainda qual o significado
fisiológico da pró-hepcidina53. Correlações significativas foram encontradas
apenas na doença da ferroportina54, na doença renal terminal55 e na anemia da
Paramiloidose Familiar (PAF)56. Recentemente foi descrito um método de ELISA
competitivo que é capaz de detectar com precisão e reprodutibilidade alterações
fisiológicas e patológicas nos níveis de hepcidina-25 no soro e urina57. No
entanto a sua comercialização tem sido difícil, muito provavelmente pela
dificuldade em garantir grandes stocks de anticorpo, dificuldade esta atribuída
ao pequeno tamanho da molécula alvo (apenas 25 aminoácidos), à sua estrutura
compacta e complexa, e à grande conservação genética entre espécies, o que
torna difícil a indução de uma resposta imune nos modelos hospedeiros.
7. Conclusões
A descoberta da hepcidina revolucionou a área do metabolismo do ferro. Este
péptido provou ser a hormona há muito tempo procurada, que funciona como o
regulador central da homeostasia do ferro. A compreensão dos mecanismos da
regulação da sua expressão colocaram o fígado no centro das atenções como o
principal sensor das alterações sistémicas, e a compreensão do seu mecanismo de
acção confirmou o papel das células exportadoras de ferro, tais como o epitélio
intestinal e os macrófagos, como os principais efectores. Mas começa também a
compreender-se que a hepcidina é produzida por muitos outros tipos celulares,
podendo assim constituir uma proteína importante na regulação autócrina e
parácrina do metabolismo celular do ferro.
O papel relevante da hepcidina na hemocromatose e noutras situações de
alteração do metabolismo do ferro revelou que existe um conjunto muito
heterogéneo de patologias que têm um mecanismo patogénico comum, a desregulação
da hepcidina. Não há dúvida que o doseamento da hepcidina no soro será usado no
futuro como uma ferramenta importante no diagnóstico, classificação e
seguimento de doentes com patologias relacionadas com o ferro. No entanto,
aguarda-se ainda pelo tempo em que possamos ter um teste robusto,
comercialmente disponível e a um preço acessível, que torne o doseamento da
hepcidina um teste de rotina na prática clínica. Finalmente, a hepcidina e os
seus reguladores já são hoje vistos como potenciais alvos terapêuticos em
patologias como a sobrecarga de ferro ou a anemia da doença crónica, embora
para que tal possa ser uma realidade ainda haja necessidade de esclarecer
muitos dos mecanismos moleculares da sua síntese, maturação, secreção e acção,
e que permita uma compreensão plena da interacção entre todos os seus
reguladores.
