Desempenho de diferentes estádios embrionários no cultivo in vitro de embriões
de 'Pêra Rio' x 'Poncã'
COMUNICAÇÃO CIENTÍFICA
BIOTECNOLOGIA
Desempenho de diferentes estádios embrionários no cultivo in vitro de embriões
de 'Pêra Rio' x 'Poncã'1
Perfomance of different embryo stage of sweet orange x mandarin cultivated in
vitro
Edvan Alves ChagasI; Moacir PasqualII; Leonardo Ferreira DutraII; Adriano
Bortolotti da SilvaII, III; Jairo Osvaldo CazettaI; Flávia Carvalho SantosII;
Pollyana CardosoII
IFCAV/UNESP - Departamento de Tecnologia, Rod. Prof. Paulo Donato Castellane,
s/n, 14884-900. Jaboticabal, SP. E-mail: cazetta@fcav.unesp.br,
edyvanchagas@bol.com.br
IIDepartamento de Agricultura, Universidade Federal de Lavras (UFLA). Cx.
Postal, 37, 37200-000. Lavras, MG. E-mail: mpasqual@ufla.br
IIIBolsista BAT/FAPEMIG
Os métodos clássicos de melhoramento, utilizados na obtenção de novos híbridos
em Citrus e gêneros afins, estão limitados por problemas como apomixia,
elevadas taxas de heterozigose, incompatibilidade sexual, esterilidade
masculina e feminina, além de longo período de juvenilidade (Cameron &
Frost, 1968; Soost & Cameron, 1975). A elevada taxa de poliembrionia,
generalizada entre as espécies de Citrus, resulta normalmente em elevada taxa
de aborto do embrião zigótico, devido à competição exercida sobre ele pelos
embriões nucelares, geralmente mais vigorosos (Soost & Cameron, 1975).
Entretanto, esses embriões podem ser resgatados via cultivo in vitro em meio de
cultura adequado (Sharma et al., 1996).
O sucesso no resgate de embriões híbridos dependerá, principalmente, do estádio
em que o embrião está sendo excisado e da composição do meio de cultura
utilizado no cultivo in vitro. De maneira geral, o embrião, durante o seu
desenvolvimento, passa pelas fases globular, cordiforme, torpedo e cotiledonar,
sendo que o cumprimento destas fases é imprescindível para a perfeita formação
da plântula. Ocorre, porém, que embriões em estádios de desenvolvimento
globular e cordiforme são mais exigentes em relação ao meio de cultivo, pois
quanto mais jovens os embriões, mais difícil é o cultivo in vitro, devido ao
seu pequeno tamanho e danos durante a excisão e, mais complexas são suas
exigências nutricionais (Hu & Ferreira, 1998).
Diversos meios de cultura ou suas modificações têm sido utilizados no cultivo
in vitro de embriões em diferentes estádios de desenvolvimento embrionário de
acordo com o gênero, espécie ou variedades. Entretanto, definir o meio de
cultura e/ou sua composição, com possibilidade de sustentar o crescimento e
desenvolvimento de embriões imaturos, se constitui no aspecto mais importante
da cultura de embriões in vitro (Pasqual et al., 2001). Em razão disso, têm
sido realizados inúmeros trabalhos com o objetivo de elucidar os efeitos de
diversos fatores no cultivo in vitro de embriões de citros, dentre eles a
concentração ótima de macro e micronutrientes, vitaminas e misturas complexas
do meio de cultura MT (Morais, 1997), além de estudos de identificação dos
estádios de desenvolvimento embrionário (Ribeiro et al., 1999).
Desta forma, objetivou-se estudar o cultivo de embriões imaturos em diversos
estádios embrionários oriundos de frutos provenientes da hibridação entre
laranjeira 'Pêra Rio' x tangerineira 'Poncã' , bem como o comportamento destes
em diferentes concentrações do meio MT.
Utilizaram-se frutos com 3 a 4 cm de diâmetro, provenientes de hibridações
entre Citrus sinensis Osbeck 'Pêra Rio' x Citrus reticulata Blanco 'Poncã' . As
sementes foram removidas e tratadas com álcool 70% por cinco minutos e,
posteriormente, com hipoclorito de sódio 2%, por 20 minutos, sendo em seguida
lavadas três vezes com água destilada e autoclavada. Em condições assépticas,
os embriões no estádio globular, torpedo e cotiledonar foram excisados e
inoculados individualmente em tubos de ensaio (25 x 150 mm), contendo 15 mL de
meio de cultura MT (Murashige e Tucker, 1969), modificado com diferentes
concentrações de sais e vitaminas do próprio meio (0; 50; 100 e 150%),
acrescido de 50 g.L-1 de sacarose. Após a inoculação, os embriões foram
incubados em sala de crescimento a 27±1ºC, fotoperíodo de 16 horas e
irradiância de 32 mmol.m-2.s-1. O delineamento experimental foi inteiramente
casualizado, com 4 repetições, sendo cada repetição constituída por três tubos,
em esquema fatorial 3 x 4. Após 90 dias, as plântulas foram avaliadas com base
no comprimento da parte aérea e do sistema radicular, massa fresca e número de
folhas.
O maior comprimento da parte aérea (1,63 cm) foi obtido com embriões no estádio
cotiledonar, seguido por aqueles no estádio torpedo, independentemente da
concentração do meio de cultura utilizado (Tabela_1). O comprimento da parte
aérea aumentou linearmente com o incremento das concentrações do meio de
cultura MT para todos os estádios (Figura_1A). Embora a concentração de sais do
meio MT seja alta, o que poderia causar toxidez aos embriões, provavelmente a
alta concentração de sacarose (50 g.L-1) atua como um atenuador do meio,
evitando danos aos embriões. Hu & Ferreira (1998) citam que os carboidratos
desempenham importante papel na manutenção da osmolaridade adequada do meio de
cultura. Os mesmos autores ainda descrevem que quanto mais jovem for o embrião,
mais alta deverá ser a osmolaridade do meio.
O comprimento do sistema radicular, massa fresca e número de folhas por
plântula aumentou linearmente com o incremento das concentrações do meio MT
para os embriões nos estádios globular, torpedo e cotiledonar. Os maiores
valores para as variáveis analisadas foram obtidos com embriões no estádio
cotiledonar, seguidos por aqueles no estádio torpedo e globular (Figuras_1B, 1C
e 1D).
De maneira geral, o maior desenvolvimento de embriões foi obtido no estádio
cotiledonar, seguido pelo estádio torpedo. Independentemente do estádio em que
foram excisados, houve desenvolvimento significativo dos embriões com o
incremento das concentrações do meio de cultura MT (Figuras_1A, 1B, 1C e 1D).
Esse maior potencial de desenvolvimento dos embriões nos estádios cotiledonar e
torpedo, juntamente com a disponibilidade de nutrientes do meio de cultura,
provavelmente induziu o maior desenvolvimento destes tipos de embriões no
presente trabalho.
Carimi et al. (1998) verificaram que a germinação dos embriões de citros foi
máxima naqueles que se encontravam no estádio cotiledonar. Em contrapartida,
aqueles no estádio globular tiveram baixa germinação e desenvolvimento lento.
Quando os embriões estão em fases mais desenvolvidas adquirem uma capacidade
autotrófica e, por vezes, podem responder melhor às condições do meio de
cultura (Rhagavan, 1976 & 1980). Devido ao fato de apresentarem maior
tamanho (³ 5 mm), estes embriões germinam mais facilmente provavelmente pela
maior quantidade de reservas nutritivas presente em seus cotilédones. Ribeiro
et al. (1999), trabalhando com estádios de desenvolvimento embrionário e
localização do embrião zigótico em sementes de citros, também observaram que
embriões zigóticos que alcançaram o pleno desenvolvimento encontravam-se no
estádio cotiledonar, caracterizando menor dependência de suprimentos exógenos
para germinar e desenvolver.
Os embriões no estádio globular tenderam a apresentar menor desenvolvimento,
resultados estes que concordam com o afirmado por Bruck & Walker (1985) ao
mencionarem que o cultivo de embriões é dependente do genótipo e estádio de
desenvolvimento, sendo a taxa de germinação inversamente proporcional à idade
do embrião. Rhagavan (1976 & 1980) descreve que embriões em fase inicial de
desenvolvimento são heterotróficos e, muitas vezes, as condições ideais de
nutrição são desconhecidas. Entretanto, é interessante que se estude as
condições que viabilizem o cultivo de embriões globulares, pois, devido à
depressão endogâmica, bastante comum no gênero Citrus, quanto mais cedo
resgatá-los, maior a possibilidade de sobrevivência e melhor desenvolvimento
dos embriões zigóticos que são os mais importantes nos programas de
melhoramento.
O melhor desenvolvimento de embriões imaturos dos cruzamentos 'Pêra Rio' x
'Poncã' é obtido quando os mesmos são excisados no estádio cotiledonar e
incubados na concentração de 150% do meio de cultura MT.
