Concentrações de ANA e BAP na micropropagação de abacaxizeiro L. Merrill
(Ananas comosus) e no cultivo hidropônico das plântulas obtidas in vitro
PROPAGAÇÃO
Concentrações de ANA e BAP na micropropagação de abacaxizeiro L. Merrill
(Ananas comosus) e no cultivo hidropônico das plântulas obtidas in vitro1
The effect of ANA and BAP concentrations on the micropropagation and hydroponic
cultures of pineapple
Cristiane Elizabeth Costa de MacêdoI; Marcela Gomes da SilvaII; Fabiana Silva
da NóbregaII; Camila Pimentel MartinsIII; Paulo Augusto Vianna BarrosoIV; Magdy
Ahmed Ibrahim AlloufaV
IDepartamento de Biologia Celular e Genética - Universidade Federal do Rio
Grande do Norte - UFRN. Natal - RN, Campus Universitário, 59072-970;
cristianemacedo.costa@bol.com.br
IIEstudante de Graduação - Laboratório de Cultura de Tecidos - Departamento de
Botânica, Ecologia e Zoologia - Universidade Federal do Rio Grande do Norte -
UFRN. Natal - RN
IIIBolsista PIBIC - CNPq - Laboratório de Cultura de Tecidos - Departamento de
Botânica, Ecologia e Zoologia - Universidade Federal do Rio Grande do Norte -
UFRN. Natal - RN
IVEmbrapa Algodão, Caixa Postal 174, 58107-720 Campina Grande - PB,
pbarroso@cnpa.embrapa.br
VDepartamento de Botânica, Ecologia e Zoologia - Universidade Federal do Rio
Grande do Norte - UFRN. Natal - RN, Campus Universitário, 59072-970;
alloufa@digi.com.br
INTRODUÇÃO
A cultura do abacaxi ocupa a sétima posição na produção agrícola do estado do
Rio Grande do Norte, onde as perdas causadas por fusariose e pelo estresse
causado pela alta salinidade do solo têm dificultado o aumento da produção
desta fruta (Medeiros et al., 2001). Devido ao alto custo das práticas de
recuperação de solos com problemas acentuados de sais, e do tempo exigido para
suas execuções, torna-se necessário a identificação e seleção de culturas e
cultivares tolerantes à salinidade a serem utilizados em programas de
melhoramento genético. Técnicas de cultura de tecidos vegetais vêm sendo
largamente aplicadas, não só pela possibilidade de obter plantas mais
resistentes a fatores de estresses bióticos (fusariose) e abióticos
(salinidade), mas também pela rápida propagação clonal in vitro de plantas de
novas variedades. No caso do abacaxizeiro, tais técnicas estão sendo utilizadas
comercialmente visando a produção de novas cultivares e o aumento na quantidade
de mudas (Albuquerque, 1998). A técnica de cultivo hidropônico de plântulas
poderá ser utilizada na seleção ex vitro de somaclones de abacaxizeiro
resistentes à salinidade, isoladamente ou em associação à seleção in vitro.
Como a hidroponia permite uma distribuição homogênea dos nutrientes e do agente
seletivo (NaCl), pode constituir-se em uma ferramenta importante para a
identificação e seleção ex vitro de somaclones mais tolerantes à salinidade.
Após os primeiros trabalhos de Aghion e Beauchesne (1960), a literatura mostra
um número crescente de estudos, investigando aspectos como: sistema de
micropropagação (cultura estacionária e imersão temporária), resposta de
diferentes cultivares, tipo de explante, meio de cultura, tipos e concentrações
de fitorreguladores (Mathews & Rangan, 1979; Cabral et al., 1984; Liu et
al., 1988; Marciani-Bendezú et al., 1990; Roca & Mroginski, 1991; Ventura,
1994; Dalvesco et al., 1996; Teng, 1997; Guerra et al., 1999; Dalvesco et al.,
2000; Feuser et al., 2001; Sá, 2001).
Entretanto, apesar da técnica de micropropagação do abacaxizeiro (Ananas
comosus (L.) Merrill) ter sido estabelecida, melhorias no protocolo
regenerativo desta espécie ainda são necessárias, sobretudo no que se refere à
utilização de concentrações adequadas dos reguladores de crescimento 6-
benzilaminopurina (BAP) e ácido naftalenoacético (ANA), objetos deste trabalho.
Medeiros et al. (2001) mostraram que a utilização da associação das
concentrações de 4 e 2 mg L-1 e 2 e 1 mg L-1 de BAP e ANA, respectivamente, no
meio de cultura favorecem a multiplicação, entretanto, os brotos apresentam um
alongamento da parte aérea muito pequeno e são de difícil individualização.
Na tentativa de otimizar o processo de micropropagação do abacaxizeiro para se
obter um número suficiente de brotos com parte aérea mais alongada, permitindo
sua melhor individualização e enraizamento, foi estudada a influência de
diferentes concentrações dos fitorreguladores BAP e ANA na micropropagação do
abacaxizeiro e no desenvolvimento das vitroplântulas em cultivo hidropônico,
este último correspondendo à fase ex vitro.
MATERIAL E MÉTODOS
Cultivo in vitro
Os brotos de abacaxizeiros obtidos a partir de explantes (gemas latentes
retiradas das bases de coroas) da variedade Pérola foram inoculados em meio de
cultura básico constituído pelos sais e vitaminas de Murashige & Skoog
(1962), suplementados com 2 mg L-1 de glicina, 100 mg L-1 de myo-inositol, 30 g
L-1 de sacarose, 5,0 g L-1 de Ágar-Ágar, além dos fitorreguladores BAP (6-
benzilaminopurina) e ANA (ácido naftalenoacético) em diferentes concentrações,
estabelecendo-se assim três tratamentos (em mg L-1: T1= 1,0 de BAP + 0,5 de
ANA; T2= 0,5 de BAP + 0,25 de ANA e T3= 0,25 de BAP + 0,12 de ANA). O pH do
meio de cultura foi ajustado para 5,8, antes da autoclavagem. Para cada
tratamento, vinte brotos foram inoculados e incubados em sala de crescimento
com fotoperíodo de 16 horas de luz e temperatura de 25 ± 2ºC. Os brotos foram
subcultivados aos 30, 60 e 90 dias após a inoculação. Avaliações quinzenais
baseadas no número de brotos produzidos por broto inicial inoculado,
comprimento e número de folhas do broto inicial e produção total de matéria
fresca foram feitas até 90 dias após a inoculação. Em seguida, os brotos
iniciais foram isolados e colocados para enraizar em meio de cultura MS com a
concentração dos micro e macronutrientes reduzidos à metade e sem adição de
fitorreguladores durante 60 dias, sendo que a cada 30 dias os brotos foram
subcultivados no mesmo meio e o número de raízes formadas determinado. O
experimento foi conduzido no delineamento em blocos casualizados, com três
repetições e vinte brotos por unidade experimental.
Cultivo hidropônico
Após os 60 dias de enraizamento, as plântulas de abacaxizeiro que atingiram
altura de 4 cm nos três tratamentos estudados (T1; T2 e T3) foram fixadas em
placas de isopor ( 24 cm largura x 40 cm comprimento ) perfuradas (2 cm de
diâmetro ). As placas com as plântulas foram colocadas sobre 1/5 da solução
nutritiva de Hoagland e depositadas em bandejas plásticas (28 cm largura x 45
cm comprimento x 8 cm de profundidade ) com capacidade de 4 litros. A solução
nutritiva de Hoagland teve seu pH ajustado para 5,7-5,8 e sua aeração feita
manualmente pelo movimento da solução diariamente. A renovação ou troca da
solução nutritiva de Hoagland foi feita a cada sete dias. As bandejas plásticas
contendo as plântulas foram mantidas sob telado, durante os meses de janeiro a
maio de 2002, em Natal, estado do Rio Grande do Norte (050 45'54"de latitude
Sul, 350 12' 04" longitude Oeste e altitude de 20 metros) a uma temperatura
média de 37 ± 3°C e fotoperíodo de 12/12 horas. O experimento foi conduzido no
delineamento em blocos casualizados (DBC), com duas repetições e dez plântulas
(1 bandeja) por unidade experimental. Aos 60 dias após o início da aclimatação
foram determinados: número de folhas, altura da plântula, comprimento da raiz,
comprimento e largura mediana da folha 'D'e o diâmetro da roseta central.
Os dados, coletados, nos dois experimentos, foram submetidos à análise de
variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey (p<0.05). As barras
apresentadas nos gráficos representam o desvio padrão (SD).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na literatura, é crescente o número de trabalhos publicados mostrando que o
meio de cultura mais utilizado na micropropagação do abacaxizeiro é o MS
adicionado de alguns reguladores de crescimento para promover o aumento na
proliferação dos brotos. Neste trabalho, a adição de concentrações mais
elevadas de BAP (1,0 mg L-1) e ANA (0,5 mg L-1) no meio de cultura determinou
uma maior produção de brotos de abacaxizeiro e conseqüentemente de matéria
fresca (Figuras_1A e 1B). O aspecto quase retilíneo da evolução do peso da
matéria fresca (Figura_1B) mostra que os acréscimos no peso foram similares ao
longo das avaliações. Já para o número de brotos, o aumento foi maior nos
primeiros 45 dias para todos os tratamentos, exceto no tratamento T3, onde o
número de brotos foi igual aos 45 e 75 dias, passando a ser quase linear a
partir desta data. Resultados semelhantes, utilizando o mesmo meio de cultura
MS e as mesmas concentrações de BAP e ANA, mas outras variedades de
abacaxizeiro, foram obtidos por Guerra et al. (1999) e Dalvesco et al. (2000).
No primeiro trabalho, os autores testaram, além das variedades Pérola e
Primavera, 17 acessos pertencentes a quatro grupos varietais diferentes e
verificaram uma grande repetibilidade dos resultados com a micropropagação dos
acessos testados, demonstrando assim a eficiência e a aplicabilidade do
protocolo para a micropropagação de mudas de abacaxizeiro.
De acordo com Rocca et al. (1991), o BAP é uma das citocininas mais utilizadas
na indução de brotos. Entretanto, a concentração recomendada varia
consideravelmente entre os diferentes laboratórios que trabalham com
micropropagação de abacaxizeiro. Liu et al. (1988), trabalhando com o cultivar
Red Spanish, revelaram que a maior proliferação de brotos ocorreu em meio MS
líquido suplementado com 0,3 mg L-1 de BAP, enquanto Marciani-Bendezú et al.
(1990) e Kiss et al. (1995) obtiveram as maiores taxas de multiplicação quando
utilizaram respectivamente 4,5 e 5 mg L-1 do referido fitorregulador. Por outro
lado, Calixto & Siqueira (1996) verificaram que não houve diferença
significativa entre os níveis de BAP, que variaram de 0 a 14 mg L-1, na
proliferação de brotos de abacaxizeiro. As discrepâncias entre os resultados
obtidos pelos diversos autores e os obtidos neste trabalho devem-se
provavelmente a diferenças varietais, bem como a diferentes protocolos
utilizados.
O tratamento T1 proporcionou a maior taxa média de regeneração (5 brotos/broto
inicial inoculado, aos 90 dias), entretanto a altura dos brotos foi maior nos
tratamentos T2 e T3, mostrando que concentrações menores de BAP e ANA são mais
favoráveis ao alongamento da parte aérea (Figura_1C). Para todos os
tratamentos, o aumento da altura foi mais acentuado nos primeiros 30 dias, após
os quais apresentou-se lento, principalmente no tratamento T1. Araújo et al.
(1996) verificaram que a maior proliferação de brotos foi obtida com 3 mg L-
1 de BAP, porém nos tratamentos com 1 mg L-1 de BAP os brotos apresentaram-se
mais desenvolvidos e mais fáceis de serem subcultivados. Tal estudo, apesar de
utilizar protocolo diferente, reforça os resultados obtidos neste trabalho.
Logo, para obtenção de brotos de abacaxizeiro com taxa de crescimento e de
multiplicação in vitro equilibradas, isto é, uma quantidade de brotos que seja
suficiente e ao mesmo tempo de fácil individualização, as concentrações
intermediária (T2) e menor (T3) de BAP e ANA são as mais indicadas para serem
adicionadas ao meio de cultura. O número de folhas cresceu pouco ao longo de 90
dias e não houve diferenças significativas entre os três tratamentos (Figura
1D). Neste trabalho, as raízes foram induzidas em meio MS básico sem adição de
fitorreguladores e os brotos oriundos dos tratamentos (T2 e T3) foram os que
produziram um maior número médio de raízes (Figura_1E). Tal aspecto é
extremamente relevante, pois favorece uma redução no custo das mudas
propagadas, o que também foi observado por Dalvesco et al. (1996).
As plântulas de abacaxizeiro obtidas no cultivo in vitro em meio MS (Murashige
& Skoog, 1962), a partir dos tratamentos T1, T2 e T3 foram cultivadas em
hidroponia durante 60 dias. Após este período, as plântulas submetidas ao
tratamento T1 durante o cultivo in vitro apresentaram melhor desenvolvimento na
fase hidropônica com valores médios superiores para todos os caracteres
analisados, exceto para o número de folhas (Tabela_1). Isto indica que a
concentração dos fitorreguladores ANA e BAP, usados durante a micropropagação,
interfere no desenvolvimento das plântulas obtidas quando cultivadas em
hidroponia, sendo este efeito cumulativo e residual e mais intenso para as
concentrações mais altas dos referidos fitorreguladores.
CONCLUSÕES
1) Apesar do tratamento de maior concentração em BAP e ANA (1,0 mg L-1 e 0,5 mg
L-1, respectivamente) apresentar vantagens como maior número de brotos e massa
fresca, os tratamentos de concentrações intermediárias (BAP 0,5 mg L-1 + 0,25
mg L-1 de ANA) e menor (BAP 0,25 mg L-1 + 0,12 mg L-1 de ANA) são os mais
indicados para serem adicionados ao meio de cultura devido a maior facilidade
de individualização dos brotos.
2) As plântulas produzidas in vitro apresentam maior desenvolvimento ex-vitro,
utilizando o sistema de cultivo hidropônico, quando submetidas a concentrações
mais altas de BAP e ANA (1,0 mg L-1 e 0,5 mg L-1, respectivamente).
