Treino físico promove aumento de peso em ratos desnutridos sem causar stress
oxidativo
INTRODUÇÃO
Estudar a desnutrição precoce é importante, pois os seus efeitos podem ser
irreversíveis, como demonstrado em animais (Winick & Noble, 1966).
Entretanto, existem evidências de que o treino físico é benéfico para animais
desnutridos, pois acarreta modificações na composição corporal, diminuindo a
percentagem de gordura da carcaça desses animais, com consequente aumento da
massa magra (Crews, Fuge, Oscai, Holloszy, & Shank, 1969).
Oldfors e Sourander (1985) demonstraram que o músculo-esquelético se adapta à
desnutrição e que essa adaptação pode ser alterada pela modificação das
demandas impostas ao músculo, como acontece no exercício.
O comportamento da glicemia frente ao efeito do treino físico apresenta
controvérsia, pois há relatos de ausência de diferença (Luciano, 1991), aumento
nas concentrações (Gobatto, 1993) e ainda uma alternância de aumentos e
diminuições ao longo da experiência (Curi, Hell, & Timo-Iaria, 1990). Como
o metabolismo da glicose, assim como o das proteínas, também pode ser afetado
pela desnutrição, e o fígado é o órgão central nesse processo - além de também
sofrer com a desnutrição -, optou-se por estudar esses metabolitos em conjunto,
como marcadores da função hepática.
Somani, Frank e Rybak (1995) mostraram que tanto o exercício agudo como o
exercício crónico são capazes de elevar os níveis de superóxido dismutase (SOD)
em ratos. Em humanos, o exercício aeróbico resultou em aumento na atividade da
SOD e na atividade da glutationa peroxidase (GPx) (Miyazaki et al., 2001). No
entanto, a atividade da SOD, assim como a concentração de sulfidrilas totais no
sangue de animais desnutridos treinados, ainda não foram estudadas.
O modelo animal de exercício permite a consolidação de importantes teorias para
a prática de treino desportivo (Chimin, Araújo, Manchado-Gobatto, &
Gobatto, 2009), e avanços no entendimento dos efeitos do exercício que vão
desde modificações morfológicas (Coura, Pacheco, Simões, Moraes, &
Campbell, 2012) até à resposta imunológica (Rocha, Nascimento, Rocha,
Kashiwabara, & Pinto, 2012).
Dentre os protocolos experimentais, tem sido dado um destaque especial ao
exercício de natação (Chiyoda et al., 2009; Coura et al., 2012).
Portanto, foram objetivos deste trabalho estudar o efeito do treino físico da
natação sobre marcadores séricos de stressoxidativo, da função hepática, do
metabolismo da glicose, além de parâmetros bioquímicos e nutricionais de ratas
desnutridas. Também foi objetivo caracterizar um modelo de desnutrição.
MÉTODO
Trata-se de um estudo do tipo experimental quantitativo.
Amostra e grupos experimentais
O projeto foi aprovado pelo Comité de Ética em Pesquisa da Universidade Federal
de Ouro Preto, ofício CEP nº 036/2008. Foram utilizadas inicialmente quarenta
ratas Fischer distribuídas em dois grupos desde o nascimento até ao desmame
(vinte e oito dias de vida) da seguinte forma: a) Grupo Controlo: dezasseis
ratas que receberam dieta controlo - AIN-93M (Reeves, Nielsen, & Fahey,
1993); b) Grupo Desnutrido: dezasseis ratas que receberam dieta hipoproteica
(AIN-93M, modificado o teor de caseína para 6%).
Após o desmame, os animais foram subdivididos em quatro grupos experimentais:
a) Controlo Sedentário (CS): oito ratas alimentadas com dieta controlo, sem
treino físico; b) Controlo Treinado (CT): oito ratas alimentadas com dieta
controlo que realizaram treino físico; c) Desnutrido Sedentário (DS): oito
ratas alimentadas com dieta hipoproteica, sem treino físico; e d) Desnutrido
Treinado (DT): oito ratas alimentados com dieta hipoproteica que realizaram
treino físico.
Dietas e condições experimentais
A dieta controlo - AIN-93M (Reeves et al., 1993) - tinha a seguinte composição
em gramas para cada 1000 g de dieta: amido de milho = 715.5 g; caseína = 147.0
g; sacarose = 100 g; óleo = 40.0 g; fibra = 50.0 g; mistura de minerais = 35.0
g; mistura de vitaminas = 10.0 g; Colina = 2.5 g.
A dieta hipoproteica apresentava as seguintes modificações em relação à dieta
controlo (composição para cada 1000 g de dieta): amido de milho = 802.5 g;
caseína = 60.0 g.
As misturas de vitaminas e de minerais foram manipuladas no próprio
laboratório. As dietas foram igualmente preparadas e armazenadas sob
refrigeração (- 4 °C) até ao momento do uso. Os animais receberam água filtrada
e o seu tipo de dieta ad libitum e foram mantidos em gaiolas individuais em
ambiente com ciclos de claro/escuro de doze horas e temperatura de 25 ± 1 °C.
Treino físico
Os animais treinados foram adaptados ao meio líquido (água a 31 ± 1 °C) (Chimin
et al., 2009; Chiyoda et al., 2009) da seguinte forma: no primeiro e no segundo
dia, trinta minutos em piscina com água rasa; no terceiro e quarto dia, duas
séries de quinze minutos com cinco minutos de intervalo em piscina com água a
50 cm de profundidade; e no quinto dia nadaram trinta minutos contínuos,
mantendo a mesma profundidade do dia anterior. Da segunda à nona semana, os
animais treinados repetiram a sessão do quinto dia de adaptação, cinco dias por
semana. Os animais sedentários foram submetidos ao contacto com a água durante
trinta minutos em piscina com água rasa, durante todo a experiência, para
passarem pelo mesmo stress do manuseio diário.
Teste Oral de Tolerância à Glicose (TOTG)
O teste oral de tolerância à glicose foi realizado na última semana de
experiência, 72 horas antes do sacrifício. Os animais permaneceram em jejum por
12 horas e foram recolhidas amostras de sangue da veia caudal antes (tempo 0) e
após 30, 60 e 120 minutos da administração, por gavagem de uma solução de
glicose (concentração final de 2 g de glicose por quilograma de peso corporal)
(Moura et al., 2012). Os níveis de glicose foram determinados através do
glicosímetro digital (Accu-Check Active; Roche Diagnosis, Basel, Switzerland).
Após a recolha dos dados, foi calculada a área total sob a curva para cada
animal, aplicando a regra trapezoidal de forma automatizada através do software
Prism® da GraphPad (versão 4.03 para Windows, GraphPad Software, San Diego,
Califórnia, USA, www.graphpad.com). Os valores da área total sob a curva para
cada animal foram agrupados e as comparações foram feitas conforme os restantes
parâmetros.
Eutanásia e recolha de material biológico
Os animais foram pesados, anestesiados com isoflurano, e a eutanásia aconteceu
por ensanguinação após um jejum de oito horas. Cada gaiola foi cuidadosamente
inspecionada. O alimento e as bandejas colocadas sob as gaiolas para recolher
as fezes foram retirados para garantir que o animal não tivesse acesso sequer
às próprias fezes durante o período de jejum, evitando assim a coprofagia.
O sangue foi recolhido por secção do plexo braquial e posteriormente
centrifugado a 10000 rpm (rotações por minuto) durante quinze minutos para
obtenção do soro e plasma, que foram guardados sob refrigeração (- 4 °C). Todas
as dosagens no soro ou plasma foram realizadas até quatro dias após a
eutanásia.
Dosagens bioquímicas
As dosagens foram realizadas de acordo com as orientações do fabricante dos
kits (Labtest Diagnóstica). Foram feitas dosagens das concentrações séricas de
albumina, proteínas totais e glicose. Também foram determinadas as atividades
da aspartato aminotransferase (AST) e da alanina aminotransferase (ALT). Para
leitura das amostras foram utilizados espectrofotómetros Femto 600 S, 600 PLUS
e 700 S.
Os grupos sulfidrilas totais foram determinados através do reagente de Ellman
(DNTB), conforme a metodologia proposta por Sedlak e Lindsay (1968). Os grupos
sulfidrilas totais reagem com DNTB, formando um composto colorido que absorve
luz a 412 nm.
A determinação da Superóxido Dismutase no soro foi realizada através do kit
Fluka número 19160 (USA), que utiliza um sistema de geração de aniões
superóxido, xantina e xantina oxidase, avaliando a capacidade de a solução
teste, sob condições padrões, inibir a reação do anião superóxido com o WST (2-
(4 iodofenil) -3- (4-nitrofenil) -2H -5- tetrazolio). Esta reação, quando
ocorrida, forma um composto denominado formazan que absorve luz a 450 nm.
Tratamento estatístico
Os dados foram analisados quanto à normalidade, utilizando-se o teste de
normalidade de D'Agostino e Pearson (omnibus K2 test). Depois de verificada a
normalidade, os dados foram comparados pelo Teste t não pareado, adotando p <
0.05 para aceitar as diferenças significativas. As análises estatísticas foram
feitas utilizando-se o software Prism® da GraphPad (versão 4.03 para Windows,
GraphPad Software, San Diego, Califórnia, USA, www.graphpad.com). O tamanho do
efeito (TE) foi calculado pelo d de Cohen, através da fórmula: (Média 1 - Média
2) / Desvio Padrão do grupo controlo. Adotou-se a seguinte classificação para o
TE: < 0.20 = pequeno; > 0.50 = moderado; > 0.80 = elevado (Cohen, 1988).
RESULTADOS
O peso inicial apresentado na Tabela_1 precedeu o treino físico, portanto, não
era esperado, e não foram observadas diferenças significativas entre os grupos
por efeito do treino. Também não houve diferença para os níveis séricos de
albumina, proteínas totais, superóxido dismutase (SOD) e sulfidrilas totais
gerada pelo treino físico em nenhum dos dois estados nutricionais (Tabela_1). O
modelo de desnutrição foi caracterizado por apresentar valores inferiores ao
grupo controlo para quase todos os parâmetros representados na Tabela_1. O
único parâmetro para o qual não houve diferença significativa foi sulfidrilas
totais (Tabela_1).
Os animais CT apresentaram maior ingestão alimentar do que os animais CS, ao
passo que os animais DS e DT não apresentaram diferenças significativas (Figura
1). Na caracterização do modelo de desnutrição, os animais DS apresentaram
valores inferiores de ingestão alimentar (Figura_1).
Os animais DT apresentaram maior aumento de peso e maior peso final do que os
animais DS, enquanto os CS e CT não apresentaram diferenças significativas para
o aumento de peso e peso final (Figuras_2 e 3 respetivamente). Na
caracterização do modelo de desnutrição, os animais DS apresentaram valores
mais baixos para aumento de peso, assim como para peso final (Figuras_2 e 3
respetivamente).
Os valores de glicemia sérica foram maiores nos animais CS comparados com CT e
nos DS comparados com os DT (Figura_4). Já o teste oral de tolerância à glicose
confirmou o aumento significativo apenas para os animais CS em relação aos CT,
sendo, portanto, DS igual a DT (Figura_5). Em relação ao modelo de desnutrição,
os animais DS apresentaram valores mais baixos para glicemia sérica, assim como
para o teste oral de tolerância à glicose (Figuras_4 e 5 respetivamente).
A atividade de ALT foi maior nos animais sedentários em comparação aos
treinados nos dois estados nutricionais (Figura_6). Enquanto a atividade de AST
foi maior apenas nos animais CS em comparação aos CT (Figura_7). Na
caracterização do modelo de desnutrição, os animais DS apresentaram valores de
ALT mais elevados, assim como de AST (Figuras 6 e 7 respetivamente).
DISCUSSÃO
No final da experiência, os animais DT apresentaram maior aumento de peso e
maior peso final em comparação com os DS, mas não apresentaram diferenças
relativamente à ingestão alimentar. Esses dados justificariam a investigação do
mecanismo pelo qual o protocolo de treino aeróbico agiria, contribuindo para o
aumento de peso e de peso final dos animais desnutridos; e somam-se à discussão
iniciada por Oldfors e Sourander (1985) de que o músculo-esquelético se adapta
ao estado nutricional e de que essa adaptação pode ser alterada pela
modificação das demandas impostas ao músculo, como acontece no exercício. Na
experiência de Oldfors e Sourander (1985) foram utilizadas dietas contendo 14%
de proteína para animais controlo, dietas com 1.5% de proteína para o grupo
desnutrido; e um protocolo de corrida em esteira rolante mais intenso e com uma
maior duração (12 semanas) do que o da presente experiência. Os autores
relataram ainda que animais desnutridos sedentários sofreram mais atrofia
muscular do que animais exercitados e que o treino impediu a perda de
mitocôndrias de animais desnutridos exercitados. Também existem relatos da
ausência de diferença para o crescimento corporal de ratos DT comparados com
ratos DS. Porém, com a ocorrência de modificações na composição corporal,
verificou-se a diminuição da percentagem de gordura da carcaça de animais
desnutridos com consequente aumento da massa magra (Crews et al., 1969).
Os animais CT apresentaram o aumento esperado em relação ao nível da ingestão
alimentar, no entanto, para esses animais o protocolo de treino aparentemente
não teve o volume e a intensidade necessários para gerar modificações no
aumento de peso ou no peso final. Aumentar o volume ou a intensidade do treino
para gerar adaptações nos animais CT poderia acarretar também uma maior
mortalidade dos animais DT. Em função disso, optou-se, nessa experiência, por
manter um protocolo de treino factível por animais desnutridos provenientes da
nossa colónia que receberam a mesma dieta. Porém, a introdução da dieta
acontecia após o desmame concomitantemente com o início de um protocolo de
treino idêntico ao aqui realizado (Oliveira, 2007).
Há relatos na literatura de que animais controlo exercitados não apresentaram
diferenças para glicose sérica (Luciano, 1991), assim como existem trabalhos
que mostram que o treino pode gerar o aumento desses níveis (Gobatto, 1993). Os
resultados do presente estudo são opostos aos citados anteriormente, pois a
glicose sérica dos grupos treinados nos dois estados nutricionais estudados
foram inferiores aos valores apresentados pelos animais sedentários.
Curi, Hell, e Timo-Iaria (1990) realizaram um acompanhamento semanal da
glicemia. Em quatro semanas foi observada uma alternância dos resultados: na
primeira e última semana houve uma diminuição nos níveis de glicose sérica dos
animais CT; verificou-se um aumento dos mesmos na terceira semana; e ausência
de diferença na segunda semana. Todos esses dados indicam que a glicose sérica
pode variar muito em função do tipo de treino, o que dificulta a formulação de
uma explicação para tais modificações. No presente trabalho e nos trabalhos de
Curi et al. (1990) e Luciano (1991), não foram utilizadas sobrecargas para
aumentar a intensidade do exercício, ao passo que, no trabalho de Gobatto
(1993), houve lugar a uma sobrecarga de 5% do peso corporal do animal.
O teste oral de tolerância à glicose confirmou uma diminuição significativa na
área sob a curva para animais CT em relação aos CS. Tomados em conjunto com os
dados de glicose sérica, esses dados indicam que o treino pode ter gerado, pelo
menos para o grupo CT, um aumento na captação de glicose pelos tecidos, o que
justificaria a sua diminuição na corrente sanguínea durante o teste oral de
tolerância à glicose. Porém, não tivemos condições de testar essa hipótese.
Gobatto (1997) não encontrou diminuição da glicose sérica como um efeito do
treino, mas, no entanto, relatou um aumento significativo na captação de
glicose pelo músculo sóleo isolado de animais treinados. Caso uma maior
captação de glicose pelo músculo tenha acontecido para o grupo CT em função do
treino na presente experiência, permaneceria obscura a maneira pela qual os
animais DT apresentaram a sua glicose sérica diminuída e uma igualdade
relativamente ao grupo DS quando foi testada a tolerância oral à glicose.
Koutedakis et al. (1993), comparando indivíduos treinados e não treinados,
verificaram que o exercício aumenta de forma aguda a atividade de AST e da ALT,
e que o nível de aptidão e a duração do exercício têm relação com as atividades
dessas enzimas. Na presente experiência não se objetivou analisar os efeitos
agudos do exercício sobre as atividades das duas enzimas, mas sim se o treino
afetaria de forma crónica essas atividades. Portanto, a eutanásia aconteceu 72
horas após a última sessão de exercício. Os dados do presente estudo mostram
que o treino não gerou nem potencializou uma disfunção hepática.
O oxigénio é essencial à vida. Contudo, durante a oxidação biológica, ele pode
seguir vias alternativas que geram a produção de espécies reativas de oxigénio,
danificando lipídos, proteínas e até mesmo o ADN celular. As células protegem-
se contra os danos causados por essas espécies reativas através de enzimas de
defesa como a superóxido-dismutase (SOD), catálase (CAT) e glutationa-
peroxidase (GPx). A SOD converte o anião superóxido em peróxido de hidrogénio,
o qual é neutralizado em água e oxigénio molecular pela atividade de outras
enzimas antioxidantes, como a catálase e a glutationa-peroxidase.
O presente protocolo de exercício não modificou a atividade da SOD nem a
concentração de sulfidrilas totais no soro dos animais. Somani et al. (1995)
mostraram que tanto o exercício agudo como o exercício crónico são capazes de
elevar os níveis de atividade da SOD nos glóbulos vermelhos isolados de ratos.
Powers e Lennon (1999) explicam que, durante a fadiga, as defesas antioxidantes
se tornam mais fracas, pelo que a melhoria da atividade de enzimas
antioxidantes pode ajudar a suportar o exercício por mais tempo, atrasando a
fadiga. Não encontrámos trabalhos que tenham medido os níveis de sulfidrilas
totais no soro de animais submetidos a condições semelhantes às da presente
experiência. Esses radicais também são utilizados como marcadores gerais de
stress oxidativo no soro.
Em eritrócitos de humanos, o exercício aeróbico (diferentemente do anaeróbico)
resultou em aumento da atividade da SOD e da atividade da GPx (Miyazaki et al.,
2001), embora não tenha sido observada diferença para atividade da CAT. Além
disso, a mudança de padrão de atividade em resposta ao exercício pode ser
influenciada pelo grau de treino. Em atletas treinados, o exercício exaustivo
foi capaz de aumentar a atividade da CAT e da GPx sem modificar a atividade da
SOD de eritrócitos (Tauler, Gimeno, Aguiló, Guix, & Pons, 1999).
Aumentos transitórios nas atividades de enzimas antioxidantes (CAT, SOD e GPx)
podem ocorrem imediatamente (Terblanche, 1999) ou logo após o exercício
(Leeuwenburgh, Fiebig, Chandwaney, & Ji, 1994). No entanto, o treino físico
gera respostas adaptativas mais duradouras no tecido (Alessio, 1993).
No presente trabalho padronizou-se um protocolo de desnutrição que se iniciava
no dia do nascimento dos filhotes, perdurando durante a lactação, com a duração
de 28 dias. Para tal, foi utilizada uma dieta que continha 6% de caseína como
fonte proteica. Assim, foi possível obter um grupo de animais DS com média de
peso de 22 gramas, enquanto o grupo CS apresentava em média 58 gramas após o
mesmo período. Depois da lactação, os animais permaneceram nove semanas com a
mesma dieta, mas a metade dos animais desnutridos foi submetida ao treino
físico, completando em torno de 91 dias de vida até à eutanásia.
O modelo foi caracterizado por apresentar os sinais clássicos de desnutrição,
ou seja, diminuição de proteínas totais, de albuminas, da glicemia de jejum, do
peso, da ingestão alimentar e do aumento de peso. Além disso, verificou-se um
aumento da atividade de ALT e AST, indicadores de uma disfunção hepática.
Acrescentamos o conhecimento sobre o comportamento da glicemia de animais
desnutridos pelo presente protocolo face ao teste oral de tolerância à glicose,
mostrando que a área sob a curva desses animais é duas vezes menor do que a
área apresentada pelo grupo controlo. Interessantemente, o comportamento dos
animais DT comparados ao dos DS face ao teste não foi semelhante ao apresentado
por animais CT na comparação com os CS, gerando outra pergunta, a que é
necessário responder, em relação ao metabolismo de glicose na desnutrição.
Outra característica interessante do modelo foi a diminuição significativa
apenas para a SOD no soro, sendo a concentração de sulfidrilas totais igual na
comparação entre animais CS e DS.
Uma das limitações deste estudo está relacionada com o que o protocolo de
exercício pode representar ao nível de exigência metabólica, considerando o
volume e a intensidade do exercício aplicado no treino dos animais. Não foram
realizados testes com essa finalidade. Um próximo passo pode ser determinar o
que este protocolo representa para animais desnutridos, ou mesmo determinar a
intensidade do exercício para a próxima experiência, utilizando o conceito de
carga crítica, aplicando a metodologia utilizada por Chimin, Araujo, Manchado-
Gobatto e Gobatto (2009); ou, alternativamente, determinar a intensidade do
exercício baseado na capacidade aeróbica, conforme fizeram Coura, Pacheco,
Simões, Moraes e Campbell (2012).
O volume de treino diário também pode ser modificado para 60 minutos, conforme
foi feito nos trabalhos de Rocha, Nascimento, Rocha, Kashiwabara e Pinto
(2012), com redução do número de semanas de treino de oito para seis. Ainda
existe a opção de treinar por 60 minutos diários durante quatro semanas,
adicionando 5% de sobrepeso ao animal (Chiyoda et al., 2009); ou 60 minutos
diários com a manutenção das oito semanas de treino, estipulando uma sobrecarga
correspondente a uma percentagem da transição metabólica, como fizeram Moura et
al. (2012), modificando, assim, ao mesmo tempo, tanto o volume quando a
intensidade do exercício.
CONCLUSÕES
Conclui-se que o treino físico influenciou o aumento de peso e do peso final
dos animais desnutridos sem aumentar o stressoxidativo no soro, nem modificar a
ingestão alimentar ou causar danos hepáticos. Também não causou prejuízo ao
metabolismo da glicose mesmo em animais desnutridos. O modelo de desnutrição
padronizado para esta experiência apresentou os sinais clássicos esperados.
