Análise das regiões subteloméricas em 1180 doentes com atraso mental por FISH e
MLPA
INTRODUÇÃO
O atraso mental (AM) ou défice cognitivo é uma doença crónica com repercussões
familiares e socioeconómicas que afeta 2-3% da população em geral. As suas
causas são várias, tornando difícil a sua caracterização, como comprovado pelos
40-50% de atrasos de etiologia desconhecida. O AM pode ser causado por doenças
monogénicas, anomalias cromossómicas, agentes externos como traumatismos de
parto, infeções e agentes químicos, ou pela combinação de vários dos fatores
referidos.1
O diagnóstico de AM segundo os critérios da DMSIV2baseia-se fundamentalmente em
3 critérios: funcionamento intelectual global inferior à média, limitação na
atividade adaptativa em pelo menos duas áreas e o início das manifestações de
AM ocorrer antes dos 18 anos de idade dividindo-se em ligeiro, moderado e
grave. Em crianças com idade inferior a 7 anos torna-se difícil a sua avaliação
intelectual e daí a designação correntemente utilizada de atraso de
desenvolvimento psicomotor (ADPM), que mais tarde poderá ou não evoluir para um
AM.
As alterações das RSt são uma das principais causas de AM, associado ou não a
anomalias múltiplas, e são responsáveispor3-16%de AM idiopático.1,3,4,5Nos
eucariotas as regiões terminais dos cromossomas são constituídas por proteínas
e DNA repetitivo não codificante sendo designadas por telómeros e por
subtelómeros. Os telómeros mantêm a estabilidade cromossómica pois protegem os
cromossomas da degradação exonucleolítica e da fusão das extremidades. Entre
outras funções asseguram a completa replicação do DNA nas regiões distais dos
cromossomas e estão associados à longevidade celular.5,6,7Os subtelómeros
situam-se adjacentes aos telómeros e possuem grandes famílias de genes que
variam no número de cópias e na distribuição cromossómica. A homologia entre as
sequências subteloméricas dos vários cromossomas facilita o frequente
cruzamento de informação, originando os rearranjos cromossómicos das RSt.6O
conhecimento da estrutura destas zonas, associado à existência de rearranjos
submicroscópicos, levou ao desenvolvimento de metodologias que detetam
sequências de DNA específicas dos subtelómeros dos 22 pares de autossomas e dos
cromossomas sexuais, como a hibridação in situ com fluorescência (FISH -
Fluorescent In Situ Hybridization), a amplificação multiplex de sondas
dependentes daligação(MLPA -Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) e
os arrays de hibridação genómica comparativa (aCGH ' array-Comparative
Genomic Hybridation). Atualmente estima-se que a taxa de diagnóstico de AM pelo
estudo das RSt é de 5-7% porFISHe podeatingir os 10%comMLPA.8
O objetivo deste trabalho foi analisar as RSt num grupo de doentes com AM ou
ADPM, em que os resultados dos estudos prévios para exclusão de eventuais
causas responsáveis pelo fenótipo apresentado (eg. cariótipo, estudos para
doenças metabólicas e para síndromadex-frágil) eram normais.
METODOLOGIA
Entre 2000 e 2010, na unidade de Citogenética do Centro de Genética Médica
Jacinto de Magalhães (CGMJM), INSA, foram estudadas as RSt em 1180 doentes com
AM ou ADPM, com ou sem dismorfias. Nestes doentes foram realizados estudos
prévios que incluíram o cariótipo, estudos metabólicos e de x-frágil, sendo
excluídas as patologias mais frequentes associadas a AM/ADPM. Inicialmente
processaram-se apenas as amostras de doentes selecionados pela consulta de
Genética do CGMJM. A partir de 2007,incluíram-se também amostras de doentes
provenientes de outros centros e hospitais do país.
Para a técnica de FISH foram colhidos, a cada doente, 5ml de sangue em tubo com
heparina e, para a metodologia de MLPA, 5ml de sangue em eDtA. Os tubos foram
mantidos, durante um prazo máximo de 5 dias, a 2º-8ºC até serem processados. A
extração de DNA realizou-se no biorobot (Quiagen) seguindo-se a avaliação de
pureza e quantificação no aparelho Nanodrop.
Efetuaram-se culturas sincronizadas de linfócitos de acordo com os protocolos
da unidade, para realização da técnica de FISH em células em metafase.
A FISH foi realizada com dois protocolos distintos. Entre 2000 e 2005, foi
usado o kit Chromoprobe Multiprobe-ttM (Cytocell, UK) e, depois de 2005,
substituiu-se pelo kit totelVysion Probe Panel (Vysis, Abbott Molecular,
USA), com a vantagem deste fornecer sinais de hibridação de melhor qualidade.
Presentemente a técnica de FISH é utilizada como metodologia de confirmação de
alterações nos resultados de MLPA (metodologia de rastreio) ou se os mesmos
forem inconclusivos.
Para o estudo das RSt por MLPA foram usados em paralelo dois kits, o SALSA
MLPA kit P036 ' Human telomere-3 e o SALSA MLPA kit 070 ' Human telomere-5,
(ambos MRC-Holland), o que permitiu testar pelo menos dois Loci de cada RSt na
maioria dos cromossomas, à exceção dos sexuais que analisam as regiões
pseudoautossómicas.
Para garantir a qualidade analítica foram salvaguardados vários procedimentos:
(i) as culturas foram efetuadas em duplicado; (ii) as metafases foram
analisadas por dois operadores diferentes com desconhecimento dos resultados
obtidos individualmente; (iii) os ensaios com alterações foram sempre
confirmados: a)FISH-o procedimento técnico foi repetido noutra cultura celular;
b) MLPA -efetuou-se o estudo com nova amostra de DNA; c) após confirmação,
solicitou-se sangue dos progenitores para determinar se a anomalia foi herdada
ou de novo. Desde 2007 todo o procedimento passou a ser executado segundo as
normas do Sistema de Gestão da Qualidade (NP eN ISO 9001:2000) e do Sistema de
Gestão da Segurança e Saúde do trabalho (NP 4397:2001).
RESULTADOS
Das 1180 amostras, 60 (5,1%) apresentavam alterações nas RSt. Após estudo
complementar dos pais verificou-se que 28 (2,4%) correspondiam a rearranjos
subteloméricos que justificavam as anomalias fenotípicas (da Tabela_1), e 20
(1,7%) eram polimorfismos sem significado patológico. Nos 12 casos (1%) em que
não foi possível o estudo parental o resultado foi inconclusivo.
Do total dos doentes estudados, 202 foram referenciados com AM grave e/ou
história familiar de AM e, destes, apenas 3 apresentaram alterações nas RSt com
significado clínico (1,5%). Das 1180 amostras, em 448 foi realizado o estudo
por FISH e nas restantes 732 por MLPA, verificando-se 14 alterações St em cada
metodologia o que dá respetivamente uma percentagem de 3,1 e 1,9 de rearranjos
com importância clínica.
Dos 28 casos com rearranjos subteloméricos verificou-se que 14 eram do sexo
masculino e 14 do sexo feminino, tendo idades compreendidas entre 1 -30 anos.
Só um tinha história familiar de AM, dois tinham um AMgrave e 21 apresentavam
dismorfias. Quanto à origem das alterações, 19 ocorreram de novo, em 5 era
desconhecida e 4 foram herdadas (3 maternas e 1 paterna).
Relativamente às anomalias encontradas, observouse que em 10 casos estavam
envolvidos dois cromossomas, com monossomia da RSt de um e trissomia da RSt do
outro correspondendo, provavelmente, a cromossomas derivativos de uma
translocação recíproca;16 doentes apresentavam deleções numa determinada RSt e
um, uma duplicação (caso no 5), originando, respetivamente, monossomias e
trissomiadas regiões envolvidas. Um doente evidenciou duplicação de duas
regiões distintas, facto extremamente raro.
DISCUSSÃO
Em doentes com AM e utilizando marcadores microssatélites polimórficos
encontraram-se 6% de rearranjos subteloméricos9. Desde então, surgiram
metodologias mais rápidas -FISH6, MLPA10e aCGH11,12-que permitiram a análise
de mais doentes com AM idiopático. O maior estudo feito por FISH envolveu
12.000 pacientes e destes, 2,5% apresentavam anomalias subteloméricas incluindo
deleções, duplicações, translocações desequilibradas e rearranjos complexos
variáveis4e nos primeiros estudos com a técnica de MLPA a percentagem variava
entre 1,8% e 5,9%.10,13
Neste trabalho foi feita a análise das RSt de indivíduos que apresentavam AM ou
ADPM, com ou sem dismorfias, utilizando uma combinação das técnicas de FISH e
MLPA. No estudo por MLPA foram usados dois kits com sondas diferentes para cada
região, constituídas por genes funcionais ou por sequências codificadoras de
proteínas. Deste modo, um resultado anormal apresentaria, em princípio,
alterações com as duas sondas. No entanto, uma alteração verificada com uma só
sonda também pode significar a existência de uma anomalia com significado
clínico, uma vez que os loci alvo dos dois kits estão distanciados um do outro,
em média 40 Kb13. Nestas situações efetuou-se uma confirmação por FISH e
solicitou-se a avaliação dos progenitores. Quando foi detetada uma alteração
apenas com um dos kits, concluiu-se que esta era herdada e sem significado
clínico, sempre que um dos progenitores, fenotipicamente normal, era portador
dessa anomalia.
Detetaram-se três casos com uma deleção do braço curto do cromossoma 1 (Tabela
1) e outros dois que adicionalmente apresentavam duplicação da RSt de 14q.
Nestes, o fenótipo correspondente à deleção sobrepunha-se ao da duplicação.
Destacam-se as microdeleções encontradas nas RSt do braço longo do cromossoma 9
(3 doentes) e do braço longo do cromossoma 22 (4 doentes); no caso nº13 a
deleção estava associada a uma duplicação de RSt19q. Porém, é de salientar que
nos casos nos 22 e 23, as deleções só foram reveladas com as sondas do kit
P036. Dois doentes apresentavam monossomia da RSt do braço curto do cromossoma
4, dois revelaram monossomia da RSt do braço longo do cromossoma 10, um tinha
deleção da RSt do braço longo do 2 e, num outro, a deleção da RSt detetou-se no
braço curto do cromossoma 16. A deleção da RSt do braço curto do cromossoma 11
foi encontrada com a utilização de ambos os kits de MLPA (genes RIC-8e BET1L),
embora o locus D11S2071usado na técnica de FISHestivesse presente.
Nos casos nos 22, 23 e 26, as deleções dos genes RABL2B-St22q, EHMT1exão 24-
St9q, RIC-8e BET1L-St11p poderão corresponder a microdeleções desses genes ou a
alterações pontuais da sequência de DNA. Nestas situações, o geneticista
avaliará a correlação genótipo/fenótipo e ponderará a continuação do estudo com
outra metodologia para confirmação dos resultados encontrados.
O doente nº 8 apresentava uma deleção da RSt do braço longo do cromossoma 9 à
qual corresponde um fenótipo bem definido, (MIM *607001 ' del9q34.3), incluindo
AM grave, hipotonia, microcefalia, face achatada com hipertelorismo, sinófrio,
macroglossia e anomalias cardíacas14. As análises por FISH permitiram concluir
que a deleção era de novo e que o ponto de quebra era no locus
D9S325estendendo-se pelos genes EHMT1e MRPL41, distais em relação ao
centrómero.
Os doentes com a deleção no braço longo do cromossoma 10 apresentavam um
fenótipo que incluía AM, dismorfias faciais, anomalias cardíacas e anogenitais.
Nos casos nos 27 e 28, um com ADPM sem dismorfias e com alterações de
comportamento, e o outro com suspeita de deleção da RSt10q, confirmou-se a
deleção da RSt10q com os três kits utilizados, sendo que no caso 27 foi herdada
da mãe e no 28 foi de novo. Na situação herdada, a deleção poderia ser a
responsável pelo fenótipo, como descrito anteriormente numa família portadora
de del(10q), em que o fenótipo se agravou com a passagem de geração.15
Este trabalho traduz a experiência de 10 anos de análise das RSt por FISH e
MLPA. Embora inicialmente o MLPA tenha sido usado como metodologia de rastreio,
atualmente é um método de diagnóstico validado, mais rápido e menos dispendioso
do que a FISH. Contudo, um resultado anormal é sempre confirmado por FISH. A
microdeleção mais frequente foi a deleção 1p36 (MIM 607872), seguida das
deleções 9q34.3 e 22q13.3. A frequência dos rearranjos subteloméricos foi de
2,4%, percentagem inferior à média descrita na literatura, talvez pelo reduzido
número de doentes estudados. Comparando os resultados de FISH e de MLPA
verificamos que se detetaram respetivamente, 3,1% e 1,9% de rearranjos
subteloméricos com significado clínico, próximos dos valores descritos por
alguns autores. Não se observou uma maior probabilidade de anomalias em doentes
com AM grave e/ ou história familiar de AM e como a diversidade de fenótipo
nestes indivíduos é muito variável, não é de descartar o estudo de doentes com
diferentes graus de AM, com ou sem história familiar de AM e que tenha
associado ou não dismorfias. é de realçar a importância da comunicação entre o
laboratório e o clínico, no sentido de estabelecer corretamente a relação
genótipo/fenótipo, em certos contextos, a informação clínica foi fundamental na
valorização das alterações encontradas, permitindo distinguir anomalias com
expressão fenotípica de polimorfismos. A introdução no nosso país de novas
tecnologias - aCGH e Next-Generation Sequencing- nas quais se analisa todo
o genoma do doente, permitirá a deteção, mais rápida e economicamente mais
vantajosa, de alterações a nível dos genes, subteloméricos ou não, alargando,
assim, a possibilidade de diagnóstico nos indivíduos com AM. A posterior
investigação da origem da alteração encontrada é fundamental para o necessário
aconselhamento genético.
